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      1. 技術(shù)專欄

        ELK Biotechnology總結(jié)實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠常用的采血方法
        供稿:技術(shù)部發(fā)布時(shí)間:2022-09-20瀏覽量:5939次

        常見(jiàn)小鼠采血方法

        小鼠是科研實(shí)驗(yàn)中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,但由于其體積小,血管細(xì),采血難度大,進(jìn)而影響采血的質(zhì)量。

        ELK簡(jiǎn)要總結(jié)了常見(jiàn)的小鼠采血方法,僅供參考:

        一只成年小鼠的循環(huán)血量大約是1.5~2.5ml,大約體重的 6~8%。在對(duì)營(yíng)養(yǎng)狀況良好的小鼠進(jìn)行采血時(shí),單次采血量最多可以到達(dá)循環(huán)血量的10%,(例:若20克小鼠,它的總血量約占1.2-1.4毫升,即每次取120ul-140ul血液不會(huì)對(duì)小鼠有太大的影響)。采血之后應(yīng)該給予溫?zé)岬牡葷B溶液補(bǔ)充,可以在2~3個(gè)星期內(nèi)恢復(fù)原有的水平。兩周采血量小于血液循環(huán)的10%,單周小于7.5%,小鼠血液循環(huán)72ml/kg

        實(shí)驗(yàn)室常用抗凝劑:乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、枸櫞酸鹽、草酸鹽、肝素

        實(shí)驗(yàn)室常用采血管:(采血后立即顛倒混勻8次)

        1.黑色:枸櫞酸鈉;血沉

         

        2.淺藍(lán)色:枸櫞酸鈉;血凝試驗(yàn)(如PT、APTT)

        3.深藍(lán)色:肝素鈉或EDTA-Na2;血液微量元素

        4.紫色:EDTA-K2;血常規(guī)(血液細(xì)胞分析)

        5.綠色:肝素鋰;大部分生化、血氨

        6.灰色:血糖降解抑制劑和EDTA-Na2;血糖

        7.棕色:肝素鈉或EDTA-K2;血鉛

         

        8.淺黃色ACD管:葡萄糖、抗凝劑;血庫(kù)試驗(yàn)

        9.淺黃色SPS管:SPS液、氯化鈉溶液;血液培養(yǎng)、微生物培養(yǎng)

        尾尖采血

         

        麻醉小鼠后,用溫水(但水溫不要過(guò)高)擦拭尾巴,引起輕微的血管擴(kuò)張。

        用無(wú)菌手術(shù)刀、刀片或鋒利的剪刀,快速截?cái)嘈∈笪布?.5-1cm。如果需要多次采血,之后每次僅需截除2-3mm。

        可以從尾部向尾尖方向按摩,以增加血流(但是,這會(huì)降低血樣的質(zhì)量,增加溶血的風(fēng)險(xiǎn))。也可以用毛細(xì)采血管收集血液,或直接滴入收集管中。采血結(jié)束后,按壓傷口或使用止血?jiǎng)ㄈ缦跛徙y,6%液體火棉膠)來(lái)止血。每次采血量大約可達(dá)0.1ml。

         

        眼眶靜脈叢采血

         

        優(yōu)點(diǎn):眼眶后靜脈叢采血法方法簡(jiǎn)單,便于掌握。血流較快,采血量多,能在較短時(shí)間內(nèi)采約0.5mL血。傷口較小,愈合較快。成功率高,死亡率低。

        缺點(diǎn):不能避免組織液的混入,對(duì)于血樣要求較高的研究應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

        小鼠經(jīng)氣體麻醉后,左手拇指及食指壓迫小鼠的頸部?jī)蓚?cè),阻礙靜脈回流,使眼球充分外突,提示眼眶后靜脈叢充血。也可以將小鼠放置在側(cè)臥位,拇指與食指分別置于小鼠頭頂和下頜,將皮膚向后及向下拉。抓握時(shí)要避免對(duì)氣管施壓,否則可能會(huì)影響小鼠呼吸。

        將毛細(xì)采血管(建議采用0.5*100mm規(guī)格的毛細(xì)管,在使用前折成小段,每段大約3-4cm)置于內(nèi)側(cè)眼角處,并且以與鼻翼平面成30-45度沿內(nèi)眥插入內(nèi)眼角,滑入眼球后方,輕輕向眼底方向刺入。

        當(dāng)感到有阻力時(shí)即輕輕旋轉(zhuǎn)采血管的同時(shí)施加壓力以切開(kāi)靜脈叢,血液將通過(guò)毛細(xì)作用流入采血管。不能刺地過(guò)深,一般2-3mm即可。

        采血結(jié)束后,立即松開(kāi)手指對(duì)小鼠的壓迫,使眼球復(fù)位,同時(shí)將采血器拔出??捎酶擅耷驂鹤⊙劭?,確保止血。一般眼眶靜脈叢采血量可以達(dá)到0.2-0.3ml。

         

         

        頜下靜脈采血

         

        綁定小鼠,可將小鼠側(cè)臥,使小鼠頭部盡量固定。在小鼠嘴角沿線與外眼角線橡膠處找到頜下靜脈的大致位置,會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)無(wú)毛的小點(diǎn),有點(diǎn)像酒窩,基本位于嘴角遠(yuǎn)端稍低于下巴線。

        針保持垂直于皮膚表面,刺入皮膚。深度不超過(guò)針頭的斜面(約3mm)。拔出針頭后,血液就會(huì)流出。為方便采血,可使小鼠頭部低于心臟高度。采血結(jié)束后,按壓以止血。一般采血量為0.2-0.5ml。

         

        隱靜脈采血(總量5%)

         

        將小鼠置于固定管或架中,但保持后腿可自由活動(dòng),剃除跗部的毛。為使膝蓋與踝關(guān)節(jié)之間的隱靜脈更加明顯,可以在后腿膝蓋以上使用止血帶。在近尾側(cè)的皮膚表面可以找到隱靜脈。

        針垂直于皮膚表面扎破血管。不要進(jìn)針過(guò)深,以免刺穿肌肉或碰到骨頭。血液會(huì)從入針處慢慢流出,用毛細(xì)采血管收集,并松開(kāi)止血帶。采血結(jié)束后,按壓傷口或使用止血?jiǎng)ㄈ缦跛徙y)以止血,并將小鼠放回籠內(nèi)。

         

         

        舌下靜脈采血

         

        將小鼠麻醉后仰臥于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上并固定。用眼科彎鑷將小鼠舌頭拉出,可明顯看到小鼠舌下靜脈。

        持采血針與舌面呈10°夾角插入舌下靜脈,見(jiàn)有回血緩慢抽取,直至采到所需血量。

         

        頸靜脈采血

         

        該方法采血量( 0.2 ml至近全血量) 及采血次數(shù)( 1~8次/d) 可隨分析目的而變動(dòng),適用于人手少、動(dòng)物數(shù)量多、實(shí)驗(yàn)時(shí)間緊以及藥代動(dòng)力學(xué)等需連續(xù)少量取血的研究中。但要求技術(shù)熟練, 方能得心應(yīng)手。在一定時(shí)間內(nèi), 如果采血量和采血次數(shù)增加, 會(huì)使動(dòng)物引起一定的應(yīng)激性反應(yīng)或采血部位的傷害。

        將動(dòng)物胸前區(qū)采血部位皮膚消毒, 于胸前正中線約第四肋骨水平先用注射器針頭沿水平方向刺入皮膚。

        再向頸靜脈所在位置沿皮下進(jìn)針, 針頭到達(dá)頸靜脈所在位置時(shí), 輕引注射器內(nèi)筒使之呈負(fù)壓, 再使注射器與胸部表面成30°~ 40°角向頸靜脈刺入, 此時(shí)注射器應(yīng)與頸靜脈走行方向相一致。

        在刺入過(guò)程中, 速度要緩慢, 刺入的深度約5 mm, 在試探性緩慢刺入或拔出時(shí), 如有血液自動(dòng)流入注射器內(nèi)筒, 說(shuō)明針尖已在頸靜脈內(nèi), 此時(shí)固定好動(dòng)物, 勿使注射器針頭移動(dòng)。

        也可將采血針抵在動(dòng)物胸骨上以便于操作, 小心抽引注射器內(nèi)筒, 待血液足夠時(shí), 拔出采血針, 用干棉球按壓止血。

         

        尾靜脈采血

         

        一個(gè)人可以用微型手電筒或LED小夜燈等緊貼尾靜脈,在燈光的照射下,尾靜脈會(huì)被很清晰的顯示,提高成功率。

        固定器(自行設(shè)計(jì))小鼠,將尾巴拉直,用酒精棉球擦拭尾巴或者用熱水或者熱毛巾焐熱尾巴(熱水浸泡鼠尾), 使尾部靜脈擴(kuò)張。

        用左邊手的食指,中指,無(wú)名指及大拇指將小鼠尾巴固定。

        握住1ml 注射器(選用29G的針頭為宜)前面0.1ml處,右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處斜15°角緩慢進(jìn)針(鼠尾遠(yuǎn)端約1/3的位置)。適當(dāng)增加內(nèi)壓看有無(wú)回血,若有回血?jiǎng)t緩慢抽取所需血量,棉簽按壓止血。

         

         

        頜下靜脈采血

         

        將小鼠麻醉后,平躺放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,中指、食指固定小鼠尾部。

        用刀片輕劃小鼠尾側(cè)靜脈或尾正中動(dòng)脈。待血液流出后,用移液槍吸取血液。取血完畢后,棉簽按壓止血。

         

         

        腹主動(dòng)脈采血

         

        優(yōu)點(diǎn):采血法取血量大、不易溶血,血液質(zhì)量較好,適用于多項(xiàng)目檢測(cè),且不損傷器官,有利于病理組織學(xué)檢查。

        缺點(diǎn):操作比較復(fù)雜,應(yīng)注意掌握適當(dāng)?shù)穆樽砩疃?,防止心跳驟停,同時(shí)防止大鼠躁動(dòng)。本方法造成的出血速度快,易造成出血性的心臟停跳,故要防止采血過(guò)程中出血。且本方法采血過(guò)程中如多次采血不宜拔出針頭。

        將大鼠腹腔注射麻醉劑后,直到身體全身變軟,把大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,背部可以放置—粗試管以充分暴露腹主動(dòng)脈。

        常規(guī)消毒后用手術(shù)剪刀沿腹正中線剪開(kāi)腹腔,用小鑷子輕輕扒開(kāi)血管周圍脂肪,再用棉球把覆蓋在血管的多余脂肪擦干凈,直到清晰看清血管為止(用棉球可以盡量減少小血管破裂出血,影響接下來(lái)進(jìn)針時(shí)的視線)。

        找腹主動(dòng)脈(粉)在脊柱上面,腹腔靜脈血管(比腹主動(dòng)脈粗,黑)旁,找到后,術(shù)者先固定血管,盡可避免血管移位,左手拇指和食指固定住血管兩旁的脂肪及其它臟器,無(wú)名指按住血管進(jìn)針點(diǎn)的上端,降低血壓,可以避免血液濺出。

        右手持穿刺針,針尖斜面朝下,入針角度約(小于)30度左右,朝向心端方向刺入,深度以5m左右為宜,進(jìn)針后可以用止血夾夾住針頭,可以避免麻醉不夠掙扎導(dǎo)致血管被針頭戳破。

        取完血后,用棉球輕壓針眼處,快速拔出針頭,可以反復(fù)采集多管的血樣進(jìn)行不同項(xiàng)目的測(cè)試(一般體重200~300g大鼠可采血液8~10mL)。

         

        心臟采血(非必需勿用)

         

        優(yōu)點(diǎn):取血快,血液不易凝集,心區(qū)面積大,進(jìn)針準(zhǔn)確性較高,可一針見(jiàn)血,且采血量能滿足大量試驗(yàn)需要。

        缺點(diǎn):采血成功率較小,死亡率高,心臟損傷較大,難以迅速愈合,不利于短期連續(xù)采血,亦無(wú)法確定是靜脈血還是動(dòng)脈血。

        一般有3種心臟采血的姿勢(shì):1、托起小鼠軀干使身體垂直與地面。身體直立以防止心臟的偏轉(zhuǎn)或胸部的扭曲。使用1毫升注射器和22g針頭。將針頭從胸部中央向下5mm處插入,深度5-10mm,將注射器與胸部保持25-30度;2、使小鼠仰臥固定,剪去胸前區(qū)被毛,皮膚消毒后,用左手食指在左側(cè)第3~4肋間觸摸到心搏處,右手持帶有4~5號(hào)針頭的注射器,選擇心搏最強(qiáng)處穿刺;3、使小鼠側(cè)臥,垂直于胸壁插入針頭。

        如果血液沒(méi)有立刻進(jìn)入注射器,可以輕輕抽空針管,產(chǎn)生一個(gè)真空區(qū)。

        當(dāng)注射器中出現(xiàn)血液時(shí),將針管保持靜止并輕輕地抽拉活塞芯桿,以獲得更多的血液。一般可以采到0.8-1.0ml血液。

         

        摘除眼球采血

        用左手拇指、食指和中指抓取小鼠的頸部頭皮,小指和無(wú)名指固定尾巴,輕壓需要摘取的眼部皮膚,使眼球充血突出。

        用眼科剪剪去小鼠的胡須,防止血從胡須處順流而下引起溶血。

        用眼科彎鑷夾取眼球并快速摘取,并使血液從眼眶內(nèi)流入0.5mlEP管中。待小鼠取血完畢后,斷頸處死。

         

         

        斷頭采血

        用左手拇指和食指以背部較緊的捏住小鼠頸部皮膚,并作小鼠頭部朝下的姿勢(shì)。

        右手用剪刀猛剪鼠頸,約1/2-4/5的頸部剪斷,讓血滴入容器中。

         

         

        全血、血漿、血清的區(qū)別

        全血包括血細(xì)胞和血漿的所有成分。采集全血時(shí),收集管中必須含有抗凝劑。常用的抗凝劑有:肝素、檸檬酸鈉和乙二胺乙酸酸 (EDTA)。根據(jù)不同研究需要進(jìn)行選擇。

        血漿是全血經(jīng)抗凝處理后,通過(guò)離心沉淀,獲得的不含細(xì)胞成分的液體。含有纖維蛋白原、凝血因子等。

        血清是全血未經(jīng)過(guò)抗凝處理,血凝塊聚縮釋出的液體。其中沒(méi)有纖維蛋白原和凝血因子。

        分離血漿和血清的一般方法是:2200-2500rpm 離心至少15分鐘。

        正常的血清或者血漿樣本為黃色清液,而若為偏紅,即為有紅細(xì)胞破裂而產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。避免溶血應(yīng)注意以下的事項(xiàng):

        1.采血時(shí)要避免小鼠毛發(fā)、油脂沾染血液導(dǎo)致溶血,所用的容器、注射器必須清潔干燥,不能有水或者有機(jī)溶劑。

        2.抽血時(shí)速度不要太快,速度太快會(huì)有氣泡產(chǎn)生。如果使用止血帶時(shí),止血帶不要扎的太久。

        3. 抽出的血放入試管時(shí),要先拔掉針頭再放血,同時(shí)速度不要太快。

        4. 收集分離血清的全血時(shí)應(yīng)盡量使血液直接進(jìn)入小管底部,避免管壁或管蓋上的血液在離心過(guò)程中導(dǎo)致溶血

         

        樣本出現(xiàn)溶血還可以用ELISA方法檢測(cè)嗎?

        血樣采集操作失誤、強(qiáng)力震蕩和多次凍融都有可能引起溶血發(fā)生。

        在ELISA檢測(cè)中,若樣本溶血輕微(淺紅色),仍可做ELISA檢測(cè),建議適當(dāng)增加洗板次數(shù),減少背景過(guò)高影響;若溶血嚴(yán)重(深紅色),建議重新取樣。

        樣本溶血可能會(huì)引起ELISA檢測(cè)OD值升高、結(jié)果假陽(yáng)性。

        原因可能是樣本中游離的血紅蛋白非特異性吸附在酶標(biāo)板上,血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類似過(guò)氧化物酶的活性,其作用類似于辣根過(guò)氧化物酶,進(jìn)而催化底物的反應(yīng)以增加樣品的OD值并引起假陽(yáng)性。

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