酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以簡(jiǎn)單地回答樣本中有多少蛋白質(zhì)/多肽/抗體這一基本問(wèn)題，是科研中比較常用的一種檢測(cè)方法。而這種簡(jiǎn)單的分析方法的核心，就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒(méi)有它，我們的實(shí)驗(yàn)就變成了一個(gè)二元的“是/不是”測(cè)試。有了它，我們可以深入研究生物反應(yīng)的細(xì)節(jié)。那么，是什么使得標(biāo)準(zhǔn)曲線如此強(qiáng)大呢?讓我們?cè)贓LISA的背景來(lái)討論這個(gè)問(wèn)題。

簡(jiǎn)單地說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)品就是一系列已知目標(biāo)蛋白數(shù)量的陽(yáng)性對(duì)照。例如，如果對(duì)人類IgG進(jìn)行ELISA檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線將包含逐漸減少的已知量的人類IgG，它會(huì)讓你立刻得出一系列的結(jié)論。

是否可以看到標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)？如果可以，實(shí)驗(yàn)是好的；如果沒(méi)有，就應(yīng)該進(jìn)行故障排除。也許抗體問(wèn)題，或者系統(tǒng)中的其他東西沒(méi)有得到優(yōu)化。

這是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)濃度下降時(shí)，信號(hào)是否減少？如果答案是肯定的，那就是一個(gè)好的開始。如果答案是否定的，可能在某些步驟引入了一些背景，或者移液管可能需要校準(zhǔn)。

一組適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品總是以空白結(jié)束，在空白孔中不存在標(biāo)準(zhǔn)品。如果空白孔OD值為>0.1，說(shuō)明可能引入了一些背景。

 

 

這是我們市場(chǎng)部同事在做實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)時(shí)做的“人C反應(yīng)蛋白(CRP)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（ELK1040）”這個(gè)指標(biāo)的標(biāo)曲數(shù)據(jù)（新人已記不清上一次拿移液器是多少年前）。

 

 

 

用于免疫檢測(cè)的所謂“標(biāo)準(zhǔn)曲線"其實(shí)稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測(cè)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)（可以是倍比稀釋的，也可以不是）濃度如果和相應(yīng)的吸光度（OD）值如果能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是最理想的了，這時(shí)可以通過(guò)Excel等方便的獲得擬合曲線，進(jìn)而推算出樣品的濃度值。但我們做免疫檢測(cè)很少有時(shí)候能夠有這么理想的情況，標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系，這時(shí)就不能用直線擬合的方式了，而對(duì)擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。

關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對(duì)數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而Logistic曲線則對(duì)曲線的全部都有較好的適用性。當(dāng)然，如果用于定量，還是在中間一段較好。這些方法雖然沒(méi)有一種方法可以通用，但也都可以用。關(guān)鍵在于你的標(biāo)準(zhǔn)曲線做到了S形的哪一部分，你想檢測(cè)的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃度部分可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部分可以用直線方程，中間部分可用對(duì)數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。

目前國(guó)際上普遍采用的免疫檢測(cè)擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進(jìn)一步比較正確的獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度。其實(shí)，在一個(gè)長(zhǎng)的區(qū)間內(nèi)，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。但并不是說(shuō)它就是的。事實(shí)上不僅是ELISA，其它很多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲 線，也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事，而用它來(lái)定量是另一回事。如果用來(lái)定量，S形曲線的中間段（較陡處）是比較好的，而兩端的平坦部分計(jì)算誤差會(huì)大，有時(shí)甚至?xí)艽蟆?/p>

二、做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測(cè)時(shí)有幾個(gè)問(wèn)題需要注意

1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來(lái)的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)從談起。

2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。

3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。

4、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對(duì)低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn)（除去零孔、背景孔），但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)）。

6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng)，但一般來(lái)說(shuō)，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.90（至少要有一個(gè)九），對(duì)于有些實(shí)驗(yàn)，至少要0.99甚至是0.999。