聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是在體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，由美國(guó)Kary Mullis及其同事于1985年發(fā)明。熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的應(yīng)用和自動(dòng)化裝置的發(fā)明與完善，使PCR技術(shù)進(jìn)入實(shí)用階段。該技術(shù)的發(fā)明和廣泛應(yīng)用，大大推動(dòng)了分子生物學(xué)各相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，發(fā)明者也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

隨著PCR技術(shù)的成熟，派生了不少相關(guān)技術(shù)。這類(lèi)技術(shù)具有敏感、特異、快速和簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣，不少?lài)?guó)家將其納入檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法；我國(guó)檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域?qū)ζ鋺?yīng)用也日益擴(kuò)大，國(guó)家要求市級(jí)以上疾病預(yù)防控制中心具有PCR檢測(cè)技術(shù)能力，用于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測(cè)和食品安全的有效監(jiān)管等。

PCR技術(shù)的基本原理和DNA在體內(nèi)天然復(fù)制過(guò)程相似，是在體外重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化形成新DNA鏈的過(guò)程，只是整個(gè)過(guò)程在體外進(jìn)行，而且反應(yīng)體系比體內(nèi)更簡(jiǎn)單。

1．體系組成和基本過(guò)程

（1）體系組成經(jīng)典PCR以DNA為模板，體系組成包括原始模板、引物、原料、DNA聚合酶以及合適的鹽、緩沖液以及溫度循環(huán)參數(shù)等。原始模板是指長(zhǎng)的雙鏈DNA待擴(kuò)增目的片段，微生物檢驗(yàn)中往往是待測(cè)標(biāo)本中的DNA。引物是兩段單鏈寡核苷酸，其序列與待擴(kuò)增片段的兩端分別相同和互補(bǔ)。原料則是4種脫氧核苷三磷酸。

（2）基本過(guò)程PCR基本過(guò)程分為變性、退火和延伸三個(gè)階段，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)實(shí)現(xiàn)目的片段的擴(kuò)增。變性是指將反應(yīng)體系混合物加熱至93℃~95℃，維持較短的時(shí)間，一般30s，使待測(cè)的雙鏈DNA在高溫作用下變性，解鏈為2條單鏈DNA模板的過(guò)程。退火是指將反應(yīng)體系混合物冷卻至特定溫度（也稱(chēng)退火溫度）。延伸是指將反應(yīng)體系的溫度提高到72℃，在耐熱DNA聚合酶作用下，以4種脫氧核苷三磷酸為原料，按堿基配對(duì)原則，合成與兩條模板DNA互補(bǔ)的2條新的DNA鏈。

2．PCR技術(shù)的特點(diǎn)PCR技術(shù)顯著的特點(diǎn)，決定了其無(wú)論在生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究，還是在微生物檢驗(yàn)方面，都具有很重要的地位。

（1）高靈敏度：產(chǎn)物量以指數(shù)方式增加，能將皮克（pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（μg=10-6）水平,能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞等等。

（2）高特異性：以堿基配對(duì)原則使引物與模板DNA特異正確的結(jié)合、DNA聚合酶合成反應(yīng)具有高度的忠實(shí)性、靶基因DNA具有高度特異性和保守性。

（3）方法簡(jiǎn)便和快速：一次性加好反應(yīng)液，于DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行變性-退火-延伸，2~4h完成擴(kuò)增反應(yīng)；而且擴(kuò)增產(chǎn)物易分析、無(wú)放射性污染、易推廣。特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)明和推廣，可以通過(guò)電腦實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，不需要再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

（4）對(duì)樣本的純度要求低及適用范圍廣：PCR技術(shù)對(duì)樣本的純度要求低，DNA粗制品可作為擴(kuò)增模板；不一定需要分離病毒、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞；可直接用臨床血液、體腔液、洗漱液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等樣本的粗制DNA擴(kuò)增檢測(cè)。適用范圍非常廣泛，不僅適合于微生物的快速檢測(cè)，還可用于臨床和法醫(yī)等各方面。

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變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

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退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

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延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開(kāi)始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

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如下圖所示，在經(jīng)歷一次變性退火延伸的流程之后，原本只有1條的DNA雙鏈變成了2條；2次之后是4條；以此類(lèi)推，只要經(jīng)歷幾十個(gè)循環(huán)數(shù)，就能產(chǎn)生大量的相同DNA片段。

以上就是常規(guī)PCR的正常流程。那在擴(kuò)增完成之后我們需要對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的DNA進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)的PCR技術(shù)通常只能借助凝膠電泳手段。這里不對(duì)電泳技術(shù)做過(guò)多介紹，其是根據(jù)DNA的分子量大小不同對(duì)DNA進(jìn)行分離，從而進(jìn)行鑒定以及純化DNA的技術(shù)。借助凝膠電泳可以判斷擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段條帶大小是否與目的條帶大小一致，從而知道是否得到了想要的產(chǎn)物；看是否有雜帶，判斷擴(kuò)增是否具有特異性；看是否有引物二聚體判斷引物的設(shè)計(jì)好壞等等。