1、樣本RNA得率以及各類(lèi)項(xiàng)目最低起始量

?

各樣本Total RNA得率統(tǒng)計(jì)（僅供參考）：

測(cè)序項(xiàng)目推薦起始量（起始量?jī)H供參考，外泌體不允許18s/28s rRNA有峰）：

表達(dá)譜芯片及小RNA測(cè)序體液樣本及外泌體項(xiàng)目起始量（僅供參考）

?

2、各類(lèi)樣本準(zhǔn)備指南

2.1 動(dòng)物組織/臨床組織采集

① 取新鮮組織，組織體積要小，盡量長(zhǎng)寬高≤0.5cm，考慮到可操作性，所切組織塊的大小可參考綠豆顆粒的大小

② 去除非研究的組織類(lèi)型（如結(jié)締組織，脂肪組織等），如果是臨床病變組織的取材要正確判斷病變以及正常組織，應(yīng)將病變組織周?chē)恼＝M織去掉，反之亦然。

③ 迅速用2-6℃預(yù)冷RNase-Free水配制的1×PBS或生理鹽水清洗組織表面的血跡和污漬，使用無(wú)塵紙巾吸干表面的液體

④ 處理好的組織迅速放入預(yù)冷好的已寫(xiě)好編號(hào)的RNase-Free的帶螺紋口的耐-192℃超低溫凍存管中，迅速置于?液氮速凍1小時(shí)后轉(zhuǎn)存于-80℃長(zhǎng)期保存，在RNA提取前避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng)：

a. 如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有條件，如缺乏液氮、干冰以及-80℃冰箱等條件下，需要RNAlater及類(lèi)似組織保存液保存的樣本，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行，迅速的將樣本分割成長(zhǎng)寬高≤0.5cm，約豌豆大小的小塊（一般重約100mg，不過(guò)無(wú)需精準(zhǔn)測(cè)量，一般需要10個(gè)小塊左右），由于組織塊過(guò)大會(huì)影響RNAlater滲透入組織內(nèi)部的效率，組織塊過(guò)大也會(huì)造成RNAlater無(wú)法完全覆蓋組織，而未被RNAlater覆蓋的組織部位極易被核酸酶降解。然后投入提前準(zhǔn)備好的裝滿RNAlater的1.5mL的EP管中，使樣本完全浸沒(méi)在液體中，然后置于4℃中保存過(guò)夜，干冰運(yùn)輸，或-80℃保存。

b. 不允許寄送用裂解液保存的組織樣本，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用Trizol保存的組織樣本，無(wú)論是研磨好的粉末還是切割好的組織塊，所抽提的RNA質(zhì)量普遍很差；

c. 動(dòng)物及臨床組織不要使用錫箔紙包裹，錫箔紙容易與動(dòng)物及臨床組織粘一起，RNA抽提的過(guò)程錫箔紙容易帶入，引起污染。

2.2 細(xì)胞樣品的采集

貼壁細(xì)胞的處理：

① 從培養(yǎng)箱取出貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞確定生長(zhǎng)狀態(tài)良好棄培養(yǎng)基

② 小心加入與培養(yǎng)基等體積的無(wú)酶水配制的1×PBS后，平放1min洗滌細(xì)胞，然后棄去PBS，重復(fù)一次

③ 加入適量裂解液反復(fù)吹打至充分裂解（以TriZol為例，10-15cm的大皿，每次先添加1-2mL，吹打混勻，裂解充分的標(biāo)準(zhǔn)為吹打時(shí)液體不粘稠，流動(dòng)性好。如果液體過(guò)于粘稠說(shuō)明還未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建議為100μL左右持續(xù)添加，直到液體不粘稠為止）

④轉(zhuǎn)移至?耐-192℃低溫的螺紋口凍存管后，-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，干冰運(yùn)輸

懸浮細(xì)胞的處理：

①選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞懸液

②200-1000g離心5-10min，得到細(xì)胞沉淀棄培養(yǎng)基

③加入適量 RNase-Free水配制的1×PBS后，寬口槍頭輕柔吹打重懸細(xì)胞沉淀，然后用200g離心5min，棄PBS， 重復(fù)一次

④加入適量TriZol裂解液反復(fù)吹打至充分裂解（裂解標(biāo)準(zhǔn)同上面的貼壁細(xì)胞處理方式類(lèi)似）

④轉(zhuǎn)移至?耐-192℃低溫的螺紋口凍存管后，-80℃長(zhǎng)期保存，干冰運(yùn)輸

注意事項(xiàng)：

a. 勿將干凍的細(xì)胞直接寄送，因?yàn)榧?xì)胞冷凍的過(guò)程中冰晶很容易刺破細(xì)胞，此時(shí)破碎的細(xì)胞會(huì)容易對(duì)RNA和RNA降解

b. 細(xì)胞樣品勿用胰酶消化，胰酶會(huì)消化細(xì)胞膜上的膜蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，破裂的細(xì)胞會(huì)釋放核酸酶。

2.3 植物組織組織采集

①選取新鮮、幼嫩、生長(zhǎng)旺盛的組織部位，植物組織越幼嫩越新鮮所含的次生代謝產(chǎn)物越少，隨著植物的逐漸成熟，所含的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量越來(lái)越多，而次生代謝產(chǎn)物會(huì)影響RNA的抽提。以草莓的花為例，這么個(gè)體量的花，4朵即可，其它花朵樣本一次類(lèi)推。

②（部分樣本可選項(xiàng)）迅速用預(yù)冷的RNase-Free水配制的1×PBS或生理鹽水清洗組織表面的污漬，吸干表面的液體。用剪刀剪切成合適的大?。ㄈ舴翘厥馇闆r，長(zhǎng)度最好不要超過(guò)2cm）

③處理好的組織迅速放入預(yù)冷好的已寫(xiě)好編號(hào)的RNase-Free的?耐-192℃低溫的螺紋凍存管中，或用標(biāo)記好名稱(chēng)的錫箔紙包裹好，?液氮速凍>1小時(shí)，轉(zhuǎn)移到-80℃長(zhǎng)期保存,在RNA提取前避免反復(fù)凍融，干冰寄送樣本。若在離體后10min未用液氮速凍降溫，極有可能引起樣本降解。不可直接將樣本放入-80℃保存，此時(shí)低活性的RNase仍能引起樣本降解

注意事項(xiàng)：

a. 植物組織不建議RNAlater保存，因?yàn)橹参锝M織含有細(xì)胞壁及次生壁，RNAlater不易滲透入組織內(nèi)部；特別是表面有蠟質(zhì)的植物種植，勿用TriZol直接浸泡植物組織

b. 不允許將植物組織磨成粉寄送。

c. 表面含有較多蠟質(zhì)的植物樣本或次生代謝產(chǎn)物含量極高的植物組織或植物組織的莖和根及種子RNA得率通常會(huì)較低，為提高RNA的得率需要加大送樣量，為普通樣本送樣量的3-4倍。

2.4 全血/PBMC/血清/血漿以及其他體液樣本搜集

聯(lián)川生物推薦使用BD公司的PAXgene?采血管采集全血，使用BD公司的真空采血管采集全血后分離血清，或使用EDTA紫色抗凝管搜集全血樣本以及分離后續(xù)的血漿樣本。不允許使用綠色的肝素采血管采集全血，因?yàn)楦嗡貢?huì)影響PCR酶的逆轉(zhuǎn)錄效率。

a. PAXgene采血管采集全血方式：

①采血前，應(yīng)將采血管恢復(fù)室溫，推薦溫度為18-25℃（一般PAXgene采血管保存于室溫或4℃，最高不超過(guò)40℃）

②采血時(shí)，假如前面已經(jīng)使用了多種采血管采集血液時(shí)，應(yīng)該在最后使用PAXgene采血管；僅用PAXgene采血管時(shí)，先用另一個(gè)采血管采集1-2mL血樣，丟棄該采血管，再使用PAXgene采血管。這種作用是因?yàn)椋裳魅莘e能被預(yù)灌注，另減少血壓造成的沖擊力，一定程度上清洗采血管，采血量：2.5ml，適用對(duì)象：人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。

③采血后，立即上下顛倒混勻十次左右，18-25℃正立放置2h。④ 若不立即提取，將采血管正立置于塑料試管架上（注意：試管架與采血管之間需留有空隙，防止低溫保存過(guò)程中管壁開(kāi)裂），先于-20℃放置24h,然后轉(zhuǎn)移至-80℃進(jìn)行長(zhǎng)期保存或轉(zhuǎn)移至干冰中進(jìn)行運(yùn)輸。注意，在這一步中需要把采血管中的全血樣本轉(zhuǎn)到螺紋口凍存管即可放入-80℃冰箱，無(wú)需再將凍存管在?液氮速凍1小時(shí)。

⑤運(yùn)輸時(shí)請(qǐng)使用厚壁泡沫盒，放入充足的干冰，在樣品保存及運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)避免反復(fù)凍融。

b. EDTA采血管/真空采血管采集全血方式：

①樣本采集前，先用75%的酒精棉由內(nèi)向四周對(duì)采血部位進(jìn)行消毒

②采血至特定的采血管中，數(shù)量達(dá)到負(fù)壓允許的最大值

③樣本采集完成后，立即輕柔顛倒混勻10次。動(dòng)作盡可能平緩。加入三倍以上體積的TriZol（TriZol:血液≥3:1）裂解液混勻，此時(shí)出現(xiàn)沉淀為正常情況。

④混勻完畢后，立刻轉(zhuǎn)入?耐-192℃低溫的螺紋口凍存管，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。注意采血至提取RNA最長(zhǎng)時(shí)間不得超過(guò)一周。

c. 血漿中PBMC提取法：

①接著上一步EDTA抗凝管離心后分層那一步，將Ficoll和PBS從低溫恢復(fù)到室溫

②向50mL離心管（標(biāo)記A）中加入10mL Ficoll，隨后最好靜置一段時(shí)間；向另一只50mL離心管（標(biāo)記B）加入10mL PBS

③稀釋?zhuān)簻睾蛽u勻抗凝采血管，用 kimwipes或者消毒紗布移除上蓋并放一邊，將 10mL血液轉(zhuǎn)移至B離心管，溫和混合，獲得PBS混合液（20mL）

④適度傾斜離心管A，將20mL PBS 混合液沿壁緩慢加入（注意要緩慢，過(guò)快會(huì)穿破Ficoll層，極大影響提取效果）

⑤梯度離心：小心地將離心管放入離心機(jī)（不要擾動(dòng)液體層），室溫400g 20min離心，加速/減速分別設(shè)置為1/0

⑥離心之后小心將其取出，放置于操作臺(tái)上，可見(jiàn)分為四層，見(jiàn)上圖

⑦可選：先移除淋巴細(xì)胞層上2-3mm的血漿，方便后面吸取

⑧用P1000移液槍盡可能吸取PBMC，轉(zhuǎn)移至15mL離心管，盡量避免吸取血漿和Ficoll

⑨加入PBS 使體積變?yōu)?0mL，蓋上蓋并溫和翻轉(zhuǎn)搖勻5次

⑩室溫 300g 10min離心，加速/減速分別設(shè)置為9/9。去上清并輕彈離心管末端，直至細(xì)胞團(tuán)在剩余PBS中完全重懸

注意事項(xiàng)：重復(fù)步驟⑨-⑩，最后按照TriZol和體積約3:1的比例加入TriZol保證充分裂解，裂解標(biāo)準(zhǔn)請(qǐng)參考上面貼壁細(xì)胞裂解液處理方式

d. 血清樣本（外泌體適用）

①建議使用進(jìn)口醫(yī)用血清管或真空采血管等收集全血

②上下輕輕顛倒混勻十次后，立即將全血置于4°C或冰盒中正立放置

③1800g 10min離心分離得到上層血清樣本（全血需在1h內(nèi)進(jìn)行血清分離，依據(jù)血清管操作說(shuō)明或客戶實(shí)驗(yàn)室血清分離步驟進(jìn)行操作）

④將血清轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，13000g離心2min；

⑤將上清轉(zhuǎn)移至規(guī)格在200μL-1.5mL耐-192℃超低溫螺紋口凍存管中，每份樣本至少≥100μL（0.1mL）。?液氮速凍1h后-80℃保存，干冰運(yùn)輸

e. 血漿樣本（外泌體適用）

①建議使用紫色EDTA抗凝管收集全血樣本

②上下輕輕顛倒混勻十次后，立即將全血置于4°C或冰盒中正立放置

③1200g 10min離心分離得到上層血漿樣本（全血需在1h內(nèi)進(jìn)行血漿分離，依據(jù)抗凝管操作說(shuō)明或客戶實(shí)驗(yàn)室血漿分離步驟進(jìn)行操作）

④將血漿轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，13000 g離心2min

⑤將上清轉(zhuǎn)移至規(guī)格在200μL-1.5mL耐-192℃超低溫螺紋口凍存管中，每份樣本至少≥100μL（0.1mL）。?液氮速凍1h后-80℃保存，干冰運(yùn)輸

注意事項(xiàng)：

a.分離血清血漿應(yīng)嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行，操作需在1h內(nèi)完成，避免出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，血清血漿分離后避免反復(fù)凍融。

b. 血清血漿送樣量的原則：越多越好，如果客戶手頭上的血清血漿量較少，則有多少就送多少，通常該種類(lèi)型的樣本RNA含量較低，所以需要通過(guò)加大樣本量以富集足夠多的RNA，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，此外血清血漿RNA通常不質(zhì)檢

c.分離血清/血漿樣本的全血不可冷凍，混入的血細(xì)胞的樣本盡量棄盡，已無(wú)法使用

d血清/血漿的RNA得率為2-8ng/mL

小貼士——

溶血現(xiàn)象解釋?zhuān)杭匆蚣t細(xì)胞細(xì)胞膜的破裂而導(dǎo)致的紅細(xì)胞破碎、血紅蛋白溢出的現(xiàn)象。溶血可由多種物理或化學(xué)因素引起，尤其在人體外，滲透壓的變化、機(jī)械外力，溫度的變化，酸堿度的變化或血液處理的過(guò)程中人為添加的一些化學(xué)物質(zhì)，均有可能引起不同程度的溶血

溶血應(yīng)對(duì)策略：(1)血液離開(kāi)人體后，血液環(huán)境的穩(wěn)定性與保存時(shí)間的長(zhǎng)短呈反比，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性也在下降，在這種情況下，應(yīng)盡快開(kāi)展血清血漿的分離；(2)不同的抗凝劑有其不同的分子構(gòu)型，會(huì)對(duì)血液中各細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生不同的作用，有的會(huì)增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，有的會(huì)降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，所以選擇一款合適的抗凝劑至關(guān)重要（抗凝劑推薦：EDTA、檸檬酸鈉）；(3)血液存放過(guò)程中溫度過(guò)高或反復(fù)凍融對(duì)細(xì)胞膜有很大的損害。溫度過(guò)高及反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而造成細(xì)胞膜的彈性降低以致破解產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，所以用于分離血清血漿的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融

f. 細(xì)胞上清液、尿液、唾液、羊水、腦脊液（外泌體相似）

①收集細(xì)胞上清液、新鮮尿液、唾液、羊水、腦脊液（起始量按照前面表格中提示），要確保不能溶血（血液中蛋白會(huì)污染樣品蛋白）；置于4°C 或冰盒中正立放置，轉(zhuǎn)移至RNase-free離心管。以下操作請(qǐng)?jiān)跇颖臼占蟮?h內(nèi)進(jìn)行，以防RNA降解

②在4°C條件下離心3000g約10 min，去除細(xì)胞及碎片

③將上清小心傾倒入新的RNase-free離心管（注意不要轉(zhuǎn)移沉淀），在4°C條件下離心13000g約2 min，去除殘留的碎片及細(xì)胞

④轉(zhuǎn)移上清至全新的耐-192℃超低溫螺紋口凍存管中，?液氮速凍1h（可選），嚴(yán)密封口。-80°C保存，干冰運(yùn)輸

注意事項(xiàng)：細(xì)胞上清液碎片過(guò)多，需要充分低速離心多次去除碎片。收集尿液的前一天飲食要清淡，晨起中段尿（臨床），晨間1h的尿液（動(dòng)物）。唾液搜集之前需要禁食禁煙禁酒2h以上，上午9:30-11:30取樣，蒸餾水漱口，將唾液吐于無(wú)菌的痰杯（保持水浴），不要咳痰，采集唾液時(shí)間為30min左右，4℃ 10000rpm 10min，取上清，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

2.5 石蠟組織

手術(shù)/活檢組織石蠟塊

RNA單次提取需35mg以上的量。從醫(yī)院病理科切取手術(shù)組織總量≥35mg（綠豆大小，不可取暴露于空氣中的組織截面部分），活檢組織長(zhǎng)度>1cm，需2-3條，蠟塊完整，無(wú)磕碰損傷的石蠟包埋組織。未切片的石蠟塊4℃或常溫運(yùn)輸即可

手術(shù)/活檢組織石蠟卷片/活檢組織石蠟切片

RNA提取一次提取<80μm。從醫(yī)院病理科切取組織厚度約為10-20μm的石蠟卷片，手術(shù)組織10張（組織>1×1cm2），或20張（組織<1×1cm2），穿刺組織20-25張。將切好的卷片放置于耐-192℃超低溫螺紋口凍存管，迅速浸入液氮速凍>1h, -80℃保存或者干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)：

a. 送樣優(yōu)先順序：?石蠟塊＞石蠟卷＞石蠟切片

b. 所有石蠟組織樣本需盡量送檢一年以內(nèi)的樣本，?不得超過(guò)18個(gè)月，建議提供一張免疫組化或組化染色切片

c. 新制切片常溫放置應(yīng)在1周以內(nèi)，2-8℃放置應(yīng)在1個(gè)月以內(nèi)，-20℃貯存應(yīng)在6個(gè)月以內(nèi)

d. 強(qiáng)烈建議每個(gè)貼片盒中只存放一個(gè)患者的樣本；若需與其他患者樣本放在一起，必須做間隔區(qū)分，防止樣本接觸造成污染

e. 強(qiáng)烈不建議使用添加瓦楞紙或自折Z形紙擺放石蠟切片，因運(yùn)輸過(guò)程中的碰撞會(huì)導(dǎo)致石蠟切片擠到一起，造成切片破損或樣本污染。

石蠟組織容器

石蠟切片示例

2.6?非致病性細(xì)菌樣本采集

一次反應(yīng)所需細(xì)菌的量≤1×107個(gè)

①顯微鏡下觀察生長(zhǎng)狀態(tài)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌；

②將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2mL旋蓋尖底R(shí)Nase-Free離心管中，室溫或4℃下14000g離心4-10min

③棄盡培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀迅速置于?液氮速凍>1h，然后轉(zhuǎn)移至-80℃或液氮中長(zhǎng)期保存，干冰運(yùn)輸

2.7?非致病性真菌樣本采集

一次反應(yīng)所需真菌的量≤50mg，將真菌稱(chēng)重，分裝多管；將稱(chēng)重后的真菌置于預(yù)冷的耐-192℃超低溫螺紋凍存管中，迅速投入液氮，速凍時(shí)間>1h，轉(zhuǎn)入-80°C長(zhǎng)期保存或用干冰直接寄出。

2.8 致病性真菌細(xì)菌處理方法

所有可能致病的真菌、細(xì)菌RNA項(xiàng)目樣品，均需要按下面步驟預(yù)處理以后才能寄送至公司，且需要提前通知實(shí)驗(yàn)室，明確菌種。溶液A，B可以向?qū)嶒?yàn)室索要。實(shí)驗(yàn)室將對(duì)未經(jīng)處理的可能致病的樣品，進(jìn)行銷(xiāo)毀處理

①細(xì)菌/真菌沉淀（不超過(guò)30mg，約綠豆大?。┘尤?00ul溶液A，吹打重懸菌體。

②在重懸的菌體中加入400ul溶液B，劇烈震蕩混勻。

③65℃水浴或金屬浴加熱30min，每隔5min劇烈震蕩一次，防止分層。

④處理結(jié)束以后，-80℃凍存，干冰運(yùn)輸。如為致病菌，請(qǐng)用70%乙醇處理容器表面（注意如處理過(guò)程中編號(hào)模糊，處理后重新寫(xiě)好編號(hào)），確保安全。

注意事項(xiàng)：

（1）室溫較低時(shí)溶液A可能析出沉淀，可65℃預(yù)熱2-3min待沉淀溶解后混勻使用。

（2） 溶液B有腐蝕性，使用注意安全操作。溶液B為有機(jī)溶液，上層液體為水封，吸取時(shí)確保將槍頭插入下層液體。

（3） 溶液A，B不互溶，操作時(shí)需要震蕩充分，使兩種液體形成乳濁液。

（4） 樣品提交單上請(qǐng)注明：樣品經(jīng)過(guò)溶液A，溶液B預(yù)處理。

2.9?Total RNA樣品

Total RNA一般長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱，若要寄送可直接使用干冰寄出，或加入適量保存液，再用干冰運(yùn)輸。

RNA的保存介質(zhì)（建議濃度>50ng/μL）：

①RNA保存液（1/10體積3M NaAc，pH=5.2，3倍體積無(wú)水乙醇）

②3倍體積無(wú)水乙醇

③RNase-free水（送樣量>15μL）

注意事項(xiàng)：

(1) total RNA中應(yīng)盡量避免多糖、蛋白、DNA等雜質(zhì)的殘留，送樣時(shí)需注明溶劑成分

(2) total RNA應(yīng)避免反復(fù)凍融，由于反復(fù)凍融所產(chǎn)生的剪切力會(huì)對(duì)RNA樣品有破壞作用，所以在實(shí)際操作中，應(yīng)對(duì)RNA樣品小量分裝

輔助材料

1. 樣本包裝注意事項(xiàng)

①在包裹樣本的鋁箔或冷凍保存管表面，用油性記號(hào)筆標(biāo)明樣本編號(hào)及樣本類(lèi)型。并且不要與乙醇等有機(jī)溶劑接觸

②不要用紗布、紙張直接包裹樣本，而是用鋁箔或冷凍保存管包裹后再裝入樣本袋中

③不要用玻璃容器在液氮中保存樣本；

④不要把標(biāo)簽紙或其他紙制的說(shuō)明性文件放入樣本袋內(nèi)，因?yàn)榧垙堅(jiān)谝旱惺且姿榈?/font>

⑤標(biāo)簽紙應(yīng)該貼于樣本袋繩上，不要貼于容器表面以免脫落造成樣本混亂

⑥ 不要在一只樣本袋中放過(guò)多的樣本，以防無(wú)法放入液氮罐或無(wú)法從液氮罐中取出。樣本袋在使用前先在液氮中預(yù)冷

⑦ 客戶在填寫(xiě)《樣本登記單》時(shí)應(yīng)當(dāng)詳細(xì)描述（臨床樣本則最好也注明臨床病因及所處階段）樣本的類(lèi)型、處理方法、儲(chǔ)存條件以及儲(chǔ)存時(shí)間等相關(guān)細(xì)節(jié)，以便技術(shù)人員確定合理的實(shí)驗(yàn)方案

3

樣本儲(chǔ)存注意事項(xiàng)

① 液氮速凍完畢后，攜帶樣本的凍存管或錫箔紙等應(yīng)該立即放入-80℃保存。常規(guī)樣本在10min內(nèi)必須立刻使用液氮速凍，不可直接將樣本在未經(jīng)液氮速凍處理后直接放入-80℃保存。未經(jīng)液氮淬滅的樣本中還會(huì)殘留低活性的酶，從而引起核酸降解以及蛋白變性

② 組織樣本采集后，樣本迅速放入進(jìn)口高質(zhì)量?jī)龃婀苤?，凍存管推薦使用進(jìn)口的并且耐低溫-192℃的螺紋口凍存管，擰緊后立即放入液氮。然后再轉(zhuǎn)移到-80℃中保存。如果因?yàn)闆](méi)有擰緊會(huì)導(dǎo)致液氮流入凍存管，空氣熱脹冷縮后發(fā)生爆炸

③ 組織樣本儲(chǔ)存于液氮或-80℃冰箱中。對(duì)于液氮保存樣本，務(wù)必注意，不要用非螺口離心管和國(guó)產(chǎn)凍存管，因?yàn)檫@些管子從液氮中取出時(shí)極易發(fā)生管子爆裂而造成樣本損失。建議使用第②條提到的凍存管。實(shí)在條件缺乏必須使用封口膜將離心管充分封鎖防止爆炸（不推薦這樣操作）

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樣本運(yùn)輸注意事項(xiàng)

① 飛機(jī)運(yùn)輸干冰上限約為20公斤，超過(guò)20公斤原則上不能運(yùn)輸?；疖?chē)運(yùn)輸不受限制。

② 干冰運(yùn)輸應(yīng)采用壁厚且質(zhì)量完好的泡沫箱，材料用編號(hào)后的凍存管存放，用塑料袋包裝后埋入干冰中，泡沫箱應(yīng)扣嚴(yán)并用封箱帶封嚴(yán)。外套紙殼箱包裝，以免碰裂。并標(biāo)明輕取輕放提示，以保證安全運(yùn)輸

③ 干冰運(yùn)輸可委托當(dāng)?shù)乜爝f公司，盡量確保48小時(shí)內(nèi)送達(dá)公司，不能送貨上門(mén)的應(yīng)提前通知公司相應(yīng)人員。

④ 24小時(shí)到達(dá)的，干冰總量不得低于5公斤；48小時(shí)到達(dá)的，干冰總量不得低于8公斤。夏季可以適當(dāng)再多增加部分干冰（平時(shí)的1.5倍）。不要使用大塊狀干冰或完全呈粉末狀的干冰，而是需要小的圓柱體干冰，否則運(yùn)輸過(guò)程中自重比較大的塊狀干冰可能會(huì)在箱內(nèi)擠壓樣品盒，移動(dòng)中可能造成樣品盒破裂。如果只有大塊狀干冰可以使用，那么裝箱時(shí)先砸碎成小塊

⑤ 包裝時(shí)建議用大塑料袋包裹干冰并在箱中放冰袋，可有效減緩干冰揮發(fā)速度。選擇合適大小，且箱壁較厚的泡沫箱，并在泡沫箱外縱橫方向都纏上透明膠，最好是將泡沫箱外壁用膠帶覆蓋一遍，帶防止運(yùn)輸途中因擠壓和拋擲而破裂。泡沫箱全部纏上膠帶后，為防止密封過(guò)緊，氣密性過(guò)強(qiáng)，干冰揮發(fā)產(chǎn)生過(guò)大壓力而造成泡沫箱爆裂，用美工刀或其他薄刃刀具，將纏在泡沫盒蓋和箱體接合處的膠帶刺破一個(gè)1-2厘米的小縫隙，以在氣壓過(guò)高時(shí)排出氣體

⑥ 如委托快遞運(yùn)輸，運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)跟蹤貨物的情況，記錄貨單號(hào)，并保持與發(fā)出地和接收地的快遞公司的聯(lián)系

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注意事項(xiàng)

① 客戶如果提供凍存可復(fù)蘇的細(xì)胞株，應(yīng)首先驗(yàn)證所用凍存方法用于RNA提取的可靠性，并且在送樣時(shí)提供詳盡的復(fù)蘇方法，以便確保實(shí)驗(yàn)成功

② 所有樣本均應(yīng)標(biāo)明準(zhǔn)確的樣本編號(hào)，同時(shí)配有一張樣本登記表，寫(xiě)明樣本名稱(chēng)、物種、編號(hào)、取樣日期、樣本處理情況等。

③ 提取RNA質(zhì)與量：a. 處于不同發(fā)育階段以及不同生長(zhǎng)條件的樣本中所含有的RNA、RNA以及蛋白的量是不同的，在某些實(shí)驗(yàn)條件下或某些病變部位獲得的樣本中核酸的量可能與常規(guī)相應(yīng)樣本有顯著的差異；b. 儲(chǔ)存條件以及儲(chǔ)存時(shí)間也是影響RNA質(zhì)與量的關(guān)鍵因素。一般來(lái)說(shuō)從新鮮的樣本中總是能夠得到預(yù)期的核酸量，并且含量相對(duì)較高，更容易檢測(cè)。但是沒(méi)有保存在液氮或-80℃冰箱中的樣本是不可靠的，因此，強(qiáng)烈建議盡可能低溫保存。

④ 關(guān)于備份，為確保實(shí)驗(yàn)的順利，我們強(qiáng)烈建議您在取樣時(shí)，應(yīng)同時(shí)備份2-3份，如備份3份，則送給我們兩份，如果備份 2份，則送樣一份，您自己留一份，以防備部分樣本降解，重新取材或送樣耽誤您的時(shí)間。即使樣本全部合格，備份的樣本您還可以用來(lái)進(jìn)行其他方面的實(shí)驗(yàn)（如定量驗(yàn)證，蛋白方面，生化方面的實(shí)驗(yàn)等）。備份又分為兩種，一種為嚴(yán)格備份，即樣本取下后一分為二，這樣的兩份樣本基本上具備同性質(zhì)。另一種為非嚴(yán)格備份，即生物學(xué)重復(fù)的樣本，這樣的備份樣本同質(zhì)性要較前者差。

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樣本寄送指南

① 將收集好的樣本置于相應(yīng)的收集管中，為防止樣本混淆管蓋和管壁均要書(shū)寫(xiě)編號(hào)，并用封口膜封口；

② 將樣本放入自封袋中，在樣本提交單上填好樣本詳細(xì)信息（編號(hào)等信息必須嚴(yán)格與樣本管上一致），將填好的樣本單和樣本一起放入泡沫箱中；

③ 選用大小合適、箱壁大于4 cm且密封性良好的泡沫箱，并在泡沫箱外縱橫方向都纏上透明膠，防止泡沫箱在運(yùn)輸過(guò)程中的開(kāi)裂。

④ 樣本寄送步驟：

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