貼壁細(xì)胞總蛋白提?。?/p>

用TBS緩沖液潤(rùn)洗貼壁細(xì)胞2-3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板/瓶?jī)?nèi)裂解3-5min。期間反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)板/瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5mL離心管中。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

懸浮細(xì)胞總蛋白提取：

低速離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)體積的冷卻的PBS緩沖液重懸，2000rpm離心10min，吸除上清。重復(fù)以上操作兩次，收集細(xì)胞沉淀。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

組織總蛋白提取：

組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4℃13000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

胞漿胞核蛋白提取：

收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的漿蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)中，振蕩混勻15 秒，使細(xì)胞完全懸浮并分散開(kāi)。如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有完全懸浮并分散開(kāi)，可以適當(dāng)延長(zhǎng)振蕩混勻時(shí)間。冰浴30 min。高速振蕩混勻5 秒，4℃13000g 離心10 min。吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞漿蛋白。吸盡上清(上清盡量去凈，避免漿蛋白污染)，加入適當(dāng)體積的核蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，高速振蕩混勻15 秒，使沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。冰浴30min，每隔5min劇烈振蕩混勻10～20s， 4℃13000g離心10 min。吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細(xì)胞核蛋白。